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Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（基础质控与过滤）（一）(强烈的建议)
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作为现在最火的scRNAseq分析包，Seurat当之无愧。😘 本期开始我们介绍一下Seurat包的用法，先从基础质控和过滤开始吧。🥳
2.用到的包rm(list = ls())library(Seurat)library(tidyverse)library(SingleR)library(celldex)library(RColorBrewer)library(SingleCellExperiment)3. 示例数据3.1 读取10X文件这里我们提供一个转成gene symbols的可读文件，如果大家拿到的是Ensemble ID，可以用之前介绍的方法进行转换。
adj.matrix <- Read10X("./soupX_pbmc10k_filt")3.2 创建Seurat对象srat <- CreateSeuratObject(adj.matrix,project = "pbmc10k")srat3.3 查看Seurat对象str(srat)4. 提取meta.data这里我们提取一下meta.data，顺便查看一下表头，主要是三列: 👇
dataset ID；UMI/cell (nCount_RNA);detected genes/cell (nFeature_RNA)。meta <- srat@meta.datahead(meta)5.添加信息5.1 添加线粒体基因信息不知道大家还记得线粒体基因吗???🤒 在scRNA-seq中，线粒体基因高表达往往代表细胞状态不佳。🧐
srat[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^MT-")head(srat$percent.mt)5.2 添加核糖体基因信息这里我们试一下添加核糖体基因的信息。👀
srat[["percent.rb"]] <- PercentageFeatureSet(srat, pattern = "^RP[SL]")head(srat$percent.rb)6. 去除双细胞scRNAseq的理想情况是每个barcode下只有一个细胞，但在实际情况中会有两个或多个细胞共用一个barcode，我们称之为doublets。🫠
识别并去除doublets的方法很多，常用的有：👇
Scrublet;doubletCells;cxds;bcds;Hybrid;DoubletDetection;DoubletFinder;Solo;DoubletDecon。这里推荐大家使用DoubletFinder，我们就不进行演示了，以后再做具体介绍。🤗
因为我们事先使用Scrublet做过处理了，这里就直接导入准备好的文件吧。
doublets <- read.table("./scrublet_calls.tsv",header = F,row.names = 1)colnames(doublets) <- c("Doublet_score","Is_doublet")srat <- AddMetaData(srat,doublets)head(srat[[]])7. 可视化7.1 小提琴图这里我们用VlnPlot探索一下特征的分布情况。
VlnPlot(srat, fill.by = "feature", # "feature", "ident" features = c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt","percent.rb"), ncol = 4, pt.size = 0.1) + theme(plot.title = element_text(size=10))7.2 散点图这里利用散点图，我们看一下不同变量间的相关性。
FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")FeatureScatter(srat, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.rb")FeatureScatter(srat, feature1 = "percent.rb", feature2 = "percent.mt")FeatureScatter(srat, feature1 = "nFeature_RNA", feature2 = "Doublet_score")Note!
这里我们可以看到高线粒体基因与低UMI计数相关，可以理解为死细胞。 🫠再看一下核糖体基因与线粒体基因，显著负相关。 😉doublet和基因表达数之间也有一定的相关性。8. 添加信息8.1 过滤接着我们定义一下过滤条件，将质量差、非单细胞的数据剔除掉。🫵
srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$Is_doublet == 'True', 'Doublet','Pass')srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC == 'Pass', 'Low_nFeature', srat@meta.data$QC )srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC != 'Pass' & srat@meta.data$QC != 'Low_nFeature', paste('Low_nFeature', srat@meta.data$QC, sep = ','), srat@meta.data$QC )srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$percent.mt > 15 & srat@meta.data$QC == 'Pass', 'High_MT',srat@meta.data$QC )srat[['QC']] <- ifelse(srat@meta.data$nFeature_RNA < 500 & srat@meta.data$QC != 'Pass' & srat@meta.data$QC !='High_MT', paste('High_MT',srat@meta.data$QC,sep = ','), srat@meta.data$QC )table(srat[['QC']])8.2 可视化这里我们只将通过过滤条件的数据展示出来，大家可以和过滤前的比较一下。
VlnPlot(subset(srat, subset = QC == 'Pass'), features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt","percent.rb"), ncol = 4, pt.size = 0.1) + theme(plot.title = element_text(size=10))最后祝大家早日不卷!~
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点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰
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